辅佐庾翼

毛穆之果敢坚毅，很有其父毛宝的风范，最初担任安西将军庾翼的参军。咸康五年（339年），毛穆之的父亲毛宝阵亡，毛穆之继承父亲州陵县开国侯的爵位。 

建元二年（344年）十一月，车骑将军、江州刺史庾冰病逝，庾冰之弟庾翼接管其部众。庾翼因家事国事难以兼顾，于是留下儿子庾方之担任建武将军，代替他镇守襄阳。由于庾方之年轻，庾翼担心他不能胜任该职，于是挑选可以信赖的将领辅佐他，便挑选毛穆之担任建武将军司马，辅佐庾方之。 庾翼自己返回夏口镇守。 

平定叛乱

永和元年（345年）七月，庾翼病逝，庾翼的部将干瓒、戴羲等人作乱，杀害冠军将军曹据。毛穆之与安西长史江虨、司马朱焘、将军袁真等人共同诛杀干瓒等人 ，平定叛乱。同年八月，徐州刺史桓温接替庾翼，担任安西将军、荆州刺史等职务，桓温复以毛穆之担任其参军。 

参与北伐

永和三年（347年），毛穆之跟随桓温消灭成汉政权，因其功劳朝廷赐封他的次子为都乡侯。不久，升任扬武将军 （一作扬威将军）、颖川太守。 

永和十二年（356年），毛穆之跟随桓温北伐后秦，收复洛阳（今河南洛阳），进入关中地区。桓温上表朝廷请求任命镇西将军谢尚为都督司州诸军事，镇守洛阳。桓温准备撤军时，因为谢尚还未到达，就留下毛穆之与督护陈午、河南太守戴施率领二千人的兵力戍守洛阳，保卫皇陵。 

升平初年（357年），毛穆之升任督宁州诸军事、扬威将军、宁州刺史。 

升平四年（360年），桓温受封南郡公，朝廷因毛穆之受封的州陵县隶属南郡，于是改封毛穆之为建安侯，并担任桓温的太尉参军，加任冠军将军，把招募的士兵配给他。 

太和四年（369年），桓温北伐前燕，派毛穆之监督开凿河道一百多里，成功引汶水让桓温水军进入黄河。同年，桓温烧船撤退，任命毛穆之为督东燕四郡军事，兼任东燕太守，原官如旧。同年，豫州刺史袁真在寿春叛乱，投降前燕，桓温将要前往征讨。毛穆之以冠军将军之职兼任淮南太守，镇守历阳。 

太和六年（371年），桓温攻陷寿春，平定袁真叛乱，袁真余党逃散，桓温于是任命毛穆之为督扬州之江西军事，兼任陈郡太守，以作安抚。晋简文帝即位后，调任毛穆之为督扬州之义成、荆州五郡、雍州之京兆七郡军事，襄阳、义成、河南三郡太守，将军如旧。毛穆之与其弟毛安之都是晋简文帝亲信。不久，进升兼任梁州刺史。但不久便因病解职，后以冠军将军身份召回京城。 

助守国境

宁康元年（373年），前秦攻打蜀地，梁州刺史杨亮、益州刺史周仲孙都不能抵抗前秦的攻势，各自都弃州逃走，周仲孙因益州失守而遭免官。桓冲于是让毛穆之督梁州之三郡军事、右将军、西蛮校尉、益州刺史，兼任建平太守、假节，守卫巴郡，以其子毛球为梓潼太守。毛穆之随后便与儿子毛球率军攻打前秦，但到巴西郡时，因缺粮而退屯巴东郡。 

太元二年（377年），桓豁表任毛穆之为监沔北军事。 

太元三年（378年），前秦将领彭超进攻彭城，毛穆之以将军身份为假节、监江北军事，镇守广陵。后升任右将军、宣城内史、假节，镇守姑孰。毛穆之认为驻防地靠近京都，不再有军事警报，不应当加节，上疏辞让，朝廷同意。 

太元四年（379年），兖州刺史谢玄率兵救援彭城，成功令留守彭城的沛郡太守戴逯安全撤出彭城，然而彭城最终被前秦攻占。毛穆之在谢玄出兵后，奉诏接受荆州刺史桓冲节度。桓冲派毛穆之在沔水中游流动作战，以支援被围困在襄阳的朱序。同月，襄阳陷落，朱序被秦军俘虏。毛穆之于是率领三万兵进攻巴郡，派赵福、袁虞率水军沿江西上，以图救援被围困在魏兴的吉挹，但赵福等人被秦军击败，毛穆之退屯巴东郡 ，而魏兴后亦被秦军攻陷。不久，毛穆之病逝，朝廷追赠他为中军将军，谥号烈。 

房玄龄等《晋书》“穆之果毅有父风。”